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平板克隆实验

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细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数,但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。由于细胞生物学性状不同,细胞克隆形成率差别也很大,一般初代培养细胞克隆形成率弱,传代细胞系强;二倍体细胞克隆形成率弱,转化细胞系强;正常细胞克隆形成率弱,肿瘤细胞强。并且克隆形成率与接种密度有一定关系,做克隆形成率测定时,接种细胞一定要分散成单细胞悬液,直接接种在碟皿中,持续一周,随时检查,到细胞形成克隆时终止培养。
(1)、培养分选的两组细胞,取对数生长期的各组细胞,分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞,并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。进行一代克隆形成率检测时,进入步骤(2);进行二/三代克隆形成率检测,须再经此方法再培养一/二代,再取对数期细胞,进入步骤(2)。
(2)、将细胞悬液作梯度倍数稀释,每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中,并轻轻转动,使细胞分散均匀。置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2~3周。
(3)、经常观察,当培养皿中出现肉眼可见的克隆时,终止培养。弃去上清液,用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液,加适量Giemsa应用染色液染10~30分钟,然后用流水缓慢洗去染色液,空气干燥。
(4)、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片,用肉眼直接计数克隆,或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。
    克隆形成率 =(克隆数/接种细胞数)×100%
实验实例:

 1、平板克隆形成:分别将阴性对照靶点和目的基因有效靶点慢病毒感染细胞,四天后,将处于对数生长期的细胞消化,计数后在6孔板培养板中接种500个细胞/孔,静置培养2周,中途隔3天换液并观察细胞状态,出现肉眼可见的克隆即终止培养,用多聚甲醛固定1h,再用Giemsa染色后,计数大于10个细胞的克隆。得到的实验结果如下:

实验结论:感染了目的基因靶点病毒的细胞,克隆形成能力减弱。

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